利用间充质干细胞无血清培养基培养分离脐带间充质干细胞。

新生儿脐带

医用手术器械，生物安全柜，CO₂培养箱，6孔培养板，T25培养瓶

实验试剂

表.  MSC NutriStem^®XF Medium

1. 冻存的MSC NutriStem^® XF Supplement在室温或2-8℃解冻，避免反复冻融。

2. 配制：MSC NutriStem^® XF Basal Medium（培养基）：MSC NutriStem^® XF Supplement（添加物）：青链双抗=500ml：3ml：5ml，4℃保存，2周内使用。

注1：双抗非必须，建议原代（P0）时使用。

注2：培养基含L-Glutamine，贮藏时避免长期照光。

1. 使用DPBS溶液（BI，Cat：02-023-1A），将MSC贴壁试剂稀释100倍（1:100）。

2. 参照下表，加入适量的1X MSC贴壁试剂涂层培养皿或板。

表. 涂层过程中贴壁试剂建议使用量（05-752-1）

注1：涂层的培养皿需在无菌条件下2℃-8℃储存，需在一周内使用。（标示红色为原厂建议使用量，经过实验测试后可减半使用。）

3. 轻轻摇动培养皿，确认贴壁试剂均匀分布在培养皿表面后，用封口膜包裹涂层的培养皿。

4. 在2-8℃孵育过夜；或者在CO₂培养箱，37℃，至少孵育30分钟。

5. 接种前, 吸除贴壁试剂，再用DPBS轻轻冲洗培养皿，即可接种细胞。

1. 使用生理盐水，将NutriCoat™ 促贴壁试剂稀释500倍（1:500）。

2. 参照下表，加入适量的1X NutriCoat™ 促贴壁试剂涂层培养皿或板。
表.  涂层过程中贴壁试剂建议使用量（05-760-1-15）

注1：涂层的培养皿需在无菌条件下2℃-8℃储存，需在一周内使用。

注2：包被期间，注意包被液不可以干掉！

3. 轻轻摇动培养皿，确认贴壁试剂均匀分布在培养皿表面后，用封口膜包裹涂层的培养皿。

4. 在2-8℃孵育过夜；或者在CO₂培养箱，37℃，至少孵育1小时。

5. 接种前, 吸除贴壁试剂，用DPBS轻轻冲洗培养皿（或不需要清洗），即可接种细胞。

使用无菌的DPBS，将50X大豆胰酶抑制剂（BI，Cat：03-048-1C）稀释成1X。

注1：抑制重组胰酶消化建议方法：

第一种使用大豆胰酶抑制剂；

第二种使用PBS/DPBS清洗（2倍重组胰酶量）吹打, 离心去上清；第三种使用维持培养基抑制。

无血清培养基抑制胰酶效果较差，使用无血清培养基时建议用第一或者第二种方法抑制/清除胰酶。

注1：一般脐带取得非无菌环境，可以稍微用75%酒精润洗。

2. 置10 cm于培养皿中，剪成1~2cm脐段，剔除血管，用DPBS洗净血迹，再剪成1 mm³组织块。(图1)

3. 用无菌滴管吸取少量细小组织块均匀散布在 6 孔板 2 个孔中。

4. 37℃，5%CO₂培养箱孵育30min，以使组织块粘贴在培养皿壁上。

5. 向每孔滴加0.8 ml 完全培养基（注意沿孔壁小心滴加，勿使冲动组织块） 。

6. 37℃，5% CO₂ 培养箱孵育过夜，次日（D1）每孔再补加1 ml 完全培养基。

7. 37℃，5% CO₂ 继续培养，5天（D6）后半量换液（此时一般看不到细胞，但最快3天就可看到细胞从组织边沿爬出）。

8. 再过5天后半量换液（此时一般会有细胞爬出，但最晚可到14天会出现细胞从组织边沿爬出）(图2、图3)。

9. 每2天换一次培养液，继续培养2~4天，待细胞融度（Confluency）达到约80%后传代培养（图4）。

注1：组织块培养的关键是要保障组织块始终贴壁，换液动作要尽可能轻微，避免冲动组织块。培养基加量不能太多，以免组织块漂浮。

图1. 剔除脐带3根动静脉血管

图2. 细胞从组织块边沿爬出

图3. 细胞快速增殖

​​​​​​​图4. 传代时机成熟

MSC NutriStem^®无血清培养基能有效地培养消化法获得原代细胞，操做方式参考如下：

1. 将脐带用DPBS（BI，Cat：02-023-1A）+1%青链双抗（BI，Cat：03-031-1B）漂洗3~5次，剪成 1-2 cm大小，剔除两根动脉血管和一根静脉血管，获得华通氏胶，同时称重。

2. 将组织块剪成 3-5 mm³，移入50 ml 离心管，再加入相应比例的分离液（VC，Cat：C3501-0100）。

3. 组织块（华通氏胶g）: （分离液vol）= 1:3（1g:3ml），在分离液中添加1%青链双抗。

4. 把 50 ml 离心管横放于 37 ℃细胞培养箱，静置16小时。（若使用旋转法，则置于37 ℃细胞培养箱中旋转4 h，转速为10 rpm。）

5. 消化反应结束之前，预先在6孔板中加入1ml完全培养基（NutriStem XF Basal Medium+5%PLTGold），置于37℃细胞培养箱中孵育1小时，达到预包被的效果。

注1：推荐使用MSC Attachment Solution（BI，Cat：05-752-1F）包被，效果更好。

6. 加入和分离液等体积的0.05%EDTA （BI，Cat：03-015-1B）终止反应后，将样品转移至15ml离心管中，1200xg 离心5分钟，离心时调至最慢降速（有刹车），去除上清，溶液比较浓稠，小心不要影响下层的细胞；建议留下 2 ml 左右的溶液。

7. 以和分离液等体积的DPBS+1%青链双抗重悬细胞后，500 xg 离心 5 分钟，离心时调至最慢降速（有刹车），小心去除上清，不要影响下层的细胞；建议留下 1.5 ml左右的溶液。重复本步骤操作3次。

8. 用适量的培养基重悬细胞后（重悬后细胞悬液总体积为3 ml），计数细胞密度，即可按常规细胞培养方法接种原代细胞培养。（原代细胞推荐用NutriStem XF Basal Medium+5%PLTGold培养）

注：消化后的原代细胞，建议培养时接种密度提高10000/cm²以上；传代后即可按常规的接种密度（5000~6000/cm²）培养。

2. 根据培养皿适量加入重组胰酶-EDTA（BI，Cat：03-079-1A，T25建议使用1 ml），在37℃，5% CO₂培养箱作用3~5 min（可轻拍培养瓶帮助细胞脱落）。

3. 显微镜下观察细胞完全脱落后，使用5-10 ml稀释大豆胰酶抑制剂（SBTI，BI，Cat：03-048-1，1X），1000 rpm离心3~5 min。

4. 谨慎吸出上清，细胞团块用适当体积的完全培养基悬浮后，混匀细胞悬液。

5. 按照所需的比例进行传代或按照5000-6000cells/cm²的细胞密度将细胞接种至培养器皿中，放入37℃，5% CO₂培养箱内培养。

6. 每2-3天更换一次培养基，待细胞融合度达到80%左右时，参照上述操作步骤1~5做细胞传代；或者参照操作步骤1~3收获细胞冻存。

7. 细胞冻存：将细胞团块悬浮于适量NutriFreez® D10无血清冻存液（Cat：05-713-1）中，装入冻存管，2~8℃冰箱放置30 min，-80℃冰箱放置 24 h，转入液氮罐冻存。

注1：本方法仅供参考，用户可根据自身经验做合理调整。