Lisa J Calton,Scott D Gillingwater, Gareth W Hammond, Donald P Cooper
沃特世公司临床业务部(英国曼彻斯特阿特拉斯商业园)
简介
临床研究表明：维生素D缺乏症在世界许多地区的成人和儿童中非常普遍。除了众所周知的影响(例如与钙吸收障碍相关的佝偻病、骨质疏松症和骨软化症)外，现在越来越多的证据表明维生素D缺乏症还会增加罹患某些癌症的风险，并对许多其它疾病有一定的影响1,2。维生素D具有两种存在形式，一种是皮肤暴露于日光下所产生的维生素D3(D3) ，另一种则是存在于多种补品中的植物衍生物—维生素D2(D2)。维生素D在肝脏中代谢形成25-羟基维生素D[25OHD]，后者在肾脏中进一步代谢形成活性代谢物1,25-二羟基维生素D。25OHD的水平被认为是评价体内维生素D水平的最佳临床指标3。维生素D水平的评估对于维生素D缺乏症的诊断和补充治疗的监测非常重要。最近，相对于竞争性结合检测、免疫检测和HPLC法等其它方法，利用LC/MS/MS方法定量分析25OHD2和25OHD3在提高检测质量和降低成本方面，更加受到人们的青睐。免疫检测的主要问题是无法区分25OHD2和25OHD3，还需依靠抗体与25OHD2的交叉反应才能测定25OHD的总浓度 。如果该交叉反应低于100%，那 么D2治疗可能无法得到准确监测4。
图1. 沃特世ACQUITY UPLC/TQD的系统配置
实验
将Waters® ACQUITY® 串联四极杆检测器(TQD)与ACQUITY UPLC®联用以进行各项分析。完整的系统配置如图1所示。仪器通过MassLynx® 4.1软件在电喷雾正离子模式下运行，并采用QuanLynxTM应用软件自动进行数据处理。对锥孔电压进行优化，使得进入离子源的母离子的丰度最大化，并通过第一级四极杆选择相应的母离子进入碰撞池。利用氩气和碰撞能量促使碰撞诱导解离，生成特征性产物离子。利用此方法建立特异的多重反应监测(MRM) ，实验如表1所示。
LC条件
LC系统： Waters ACQUITY UPLC系统
色谱柱： ACQUITY UPLC BEH C8, 2.1 x 50 mm, 1.7 μm
柱温： 45 ˚C
流速： 400μL/min
流动相A：2 mM醋酸铵+0.1%甲酸的水溶液
流动相B：2 mM醋酸铵+0.1%甲酸的甲醇溶液
梯度：流动相B在73%保持2 min，在1.5 min内从73%增加至98%
MS条件
MS系统：Waters ACQUITY TQD
电离模式：ESI+
毛细管电压:2.5 kV
锥孔电压：24 V
脱溶剂气温度：400 ˚C
脱溶剂气流量：900 L/h
源温度：120 ˚C
碰撞气流速:7.10 x 10-3mbar
校准品和QC标准品
按照各个生产厂家的说明制备单一浓度的校准品和双浓度水平的QC标准品(Chromsystem，德国慕尼黑)。通过混合人血清并加入已知浓度的25OHD2和25OHD3，制备低浓度QC标准品溶液。低、中和高浓度QC样品中25OHD2的最终浓度分别为19、27和84 ng/mL，25OHD3的最终浓度则分别为13、29和89 ng/mL。使用哺乳动物血清制备校准品用以线性评估，其中25OHD2和25OHD3的浓度范围为1-100ng/mL。在264 nm下检测储备液，然后将其调整至最终浓度。
样品制备
吸取血清(150μL)至2 mL微量离心管(Anachem)中，加入10μL内标(250ng/mL六氘代25OHD3，合成AS，以80%甲醇/20% IPA为溶剂) ，涡旋混合(10s)。加入0.2 M ZnSO4溶液(150μL)并涡旋混合(10 s)以增强反应 。加入甲醇 (300μL)并混合(10s)，以沉淀血清中存在的蛋白质。加入己烷(750μL)，用以提取25OHD。混合30s，然后将样品在13000rpm下离心5 min。移取己烷层并将其置于沃特世最大回收样品瓶中，在50˚C的氮气下蒸发至干。将样品复溶于75μL70%甲醇水溶液中，借助ACQUITY样品管理器的预加载功能将20μL样品注入UPLC/MS/MS系统中，进样间隔时间为6 min。
离子抑制
将人血清样品混合低浓度的25OHD2和25OHD3并使用柱后添加对其进行分析，以100 ng/mL浓度和10 μL/min流速通过ACQUITY TQD集成式样品流路。
结果线性
使用QuanLynx定量软件和ApexTrackTM积分算法进行数据处理 。以2.5-100 ng/mL的浓度范围内向血清中加入已知浓度的25OHD2和25OHD3，对分析方法的线性进行考察。25OHD3的确定系数(R2)>0.999(图2)，计算所得的校准品浓度均在指定值的±4%范围之内。 25OHD2的确定系数(R2)>0.997(图3) ，计 算所得的校准品浓度均在指定值的±10%范围之内。
图2 .血清中25OHD3的校准曲线。
图3 .血清中25(OH)D2的校准曲线。
准确度
通过分析购自DEQAS(www.deqas.org)的外部质量控制样品考察分析方法的准确性。利用Chromsystem单点校准品绘制出一条过零点的校准曲线，用以计算DEQAS样品浓度。采用Passing-Bablok线性回归(Microsoft Office Excel 2003，带Analyse-It插件1.73版)将Waters 25OHD3的结果与通过DEQAS LC/MS方法所得的结果平均值进行对比。所有结果均在预期值的±11.5%偏差范围之内(图4)。
图4 .将Waters 25OHD3结果与DEQAS LC/MS方法所得的结果平均值进行对比的Passing-Bablok线性回归分析。
精度
通过提取低 、中和高浓度的QC样品并重复分析5次以测定批内精度。根据这三个浓度水平计算25OHD的变异系数(CV) 。对低 、中和高浓度的QC样品进行连续5天的分析，测定批间精度。结果如表2所示。
灵敏度
提取所得的最低浓度内部血清校准品的色谱图如图5所示。各色谱图标记了化合物名称、峰间信噪比(SNR)和浓度。所有响应均高于检测限(SNR 5:1)，因此，本方法可检出维生素D严重缺乏症患者的维生素D水平(<6 ng/mL)。
图5 .色谱图显示了最低浓度校准品和各个分析物的信噪比测定结果。
离子抑制
离子抑制研究表明25OHD3在离子抑制区域部分洗脱，如图6所示。
图6 .25OHD离子抑制分析，通过放大视图显示了25OHD2和25OHD3的洗脱分析结果。
需使用一种稳定同位素标记内标物来补偿所观测到的各个分析物之间的基质效应差异5
讨论
本文中开发了一种利用UPLC/MS/MS分析血清中25OHD2和25OHD3的方法。该方法通过从血清中进行液-液萃取以及利用定性和定量离子进行各个分析物定量检测。此外，通过监测定性离子比率提高了准确识别分析物的可靠性。测定结果表明，本方法具有良好的灵敏度以及批内和批间精密度。采用本方法，可以每天分析多达100个样品。
结论
本文中开发的分析血清中25OHD2和25OHD3的方法具有良好的线性、灵敏度和精度。本方法与传统的免疫测定法相比，可提供更加可靠的结果。
UPLC/MS/MS能够准确可靠地测定血清中的250HD2和250HD3，防止误报接受D2补充治疗的患者体内的维生素D总体浓度。
参考文献
1. Gorham ED, Garland CF, Garland FC, Grant WB, Mohr SB, Lipkin M,
et al. Optimal vitamin D status for colorectal cancer prevention: a
quantitative meta-analysis. Am J Prev Med 2007;32:210–6.
2. Garland CF, Gorham ED, Mohr SB, Grant WB, Giovannucci EL, Lipkin M,
et al. Vitamin D and prevention of breast cancer: pooled analysis. J
Steroid Biochem Mol Biol 2007;103:708–11.
3. Standing Committee on the Scientific Evaluation of Dietary Reference
Intakes Institute of Medicine. DRI Dietary Reference Intakes for
calcium phosphorus, magnesium, vitamin D and fluoride. National
Academy Press,Washington,DC; 1997.
4. Hollis B. Editorial: The Determination of Circulating
25-Hydroxyvitamin D: No Easy Task. J Clin Endocrinol Metab, July
2004,89(7):3149–3151.
5. Viswanathan CT. et al. Quantitative Bioanalytical Methods Validation
and Implementation: Best Practices for Chromatographic and Ligand
Binding Assays.Pharmaceutical Research 2007; 24(10):1962-1973.