2×高保真长片段快速PCR预混液（含染料）
产品名称： 2×高保真长片段快速PCR预混液（含染料）
英文名称： 2×High-Fidelity Long PCR Master Mix (With Dye)
产品编号： N132017
产品价格： null
产品产地： 美国
品牌商标： Arcegen
更新时间： 2025-07-11T09:42:51
使用范围： null
| 规格 | 价格 |
| 250 μL | 100.0 |
| 1ml | 480.0 |
| 5×1 mL | 1600.0 |
- 联系人 : 钟珍
- 地址 : 申江南路4388号1幢2层208室
- 邮编 : 201314
- 所在区域 : 上海
- 电话 : 139****6764 点击查看
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产品简介
2×High-Fidelity Long PCR Master Mix (With Dye)是即用型2×预混合溶液，包含High-Fidelity DNA Polymerase，dNTPs以及优化的缓冲体系，预混液中含有预先添加的电泳指示剂，PCR产物可直接进行电泳，扩增产物为平末端，延伸速度为10 sec/kb。其保真性是Taq DNA聚合酶的83倍，是普通Pfu DNA 聚合酶的9倍，适用于复杂模板扩增。2×High-Fidelity Long PCR Master Mix (With Dye)具有快速简便、灵敏度高、特异性强、稳定性好等优点，反应体系只需加入引物和模板即可。另外，该产品还含有特异保护剂，使得预混液反复冻融后仍可维持稳定活性。
产品信息
|
货号 |
N132017E |
N132017S |
N132017M |
|
规格 |
250 μL |
1 mL |
5×1 mL |
储存条件
-25~-15℃保存，有效期1年。
注意事项
为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
本产品仅用于科研。
使用说明
1，冰上融化试剂 ，混匀后备用。
2，冰上配制表 1 中的 PCR 扩增反应液。配制完成后充分混匀离心。
3，若模板为粗提样本 ，建议添加体积不超过反应体系的 5%。
表1. PCR 扩增反应体系
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组分 |
体积 (µL) |
|
模板(10~200ng) |
x |
|
正向引物(10 μM)* |
2 |
|
反向引物(10 μM)* |
2 |
|
2×High-Fidelity Long PCR Master Mix (With Dye) |
25 |
|
ddH2O |
Up to 50 |
*PCR 反应体系中引物终浓度范围0.4~1μM，引物终浓度过低，会影响扩增效果，若扩增效果不理想，可适当提高引物添加量，提升检出率。
4，将PCR管转移到PCR仪根据表2进行片段扩增。
5，推荐PCR扩增程序
表2. PCR 扩增反应程序
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温度 |
时间 |
循环数 |
|
98°C |
30 sec |
1 |
|
98°C |
10 sec |
30-35（根据实验要求） |
|
60°C* |
5 sec |
|
|
68°C~72°C** |
5~10 sec/kb |
|
|
72°C |
2 min |
1 |
|
4°C |
Hold |
- |
*退火温度推荐60°C，也可根据需要，设立温度梯度摸索引物退火的最适温度。推荐退火时间为5 sec ，可以在5-20 sec 内调节。退火时间太长可能导致扩增产物在胶上呈弥散状。
**延伸温度和时间：10 kb以上长片段或较高GC片段扩增，推荐使用68°C，10 kb及10 kb以下片段且gc在40%~60%的片段扩增，可以尝试72℃延伸。当扩增效果不理想时，延伸速率根据实际结果可在5 sec/kb~10 sec/kb之间进行调整，扩增片段＜10 kb时，延伸速率可选择5 sec/kb，当扩增片段≥10 kb时，延伸速率可选10 sec/kb。
6，吸取 5~8 µL 扩增产物，用1%的琼脂糖凝胶进行电泳，检测是否扩增出正确条带。
应用示例
1，Overlap PCR
1）扩增子1、扩增子2制备
表3. PCR反应体系配制（50 μL体系）
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组分 |
使用量 |
|
2×High-Fidelity Long PCR Master Mix (With Dye) |
25 μL |
|
模板 1 DNA、模板 2 DNA |
10~100 ng |
|
一轮引物 F1（10 μM）、一轮引物 F2（10 μM） |
2 μL |
|
一轮引物 R1（10 μM）、一轮引物 R2（10 μM） |
2 μL |
|
ddH2O |
To 50 μL |
表4.一轮PCR程序
|
温度 |
时间 |
循环数 |
|
98°C |
30 sec |
1 |
|
98°C |
10 sec |
30-35（根据实验要求） |
|
60°C |
5 sec |
|
|
72°C |
10 sec/kb |
|
|
72°C |
2 min |
1 |
|
4°C |
Hold |
- |
2）Overlap PCR（两扩增子融合）
表5.二轮PCR反应体系配制（50 μL体系）
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组分 |
使用量 |
|
2×High-Fidelity Long PCR Master Mix (With Dye) |
25 μL |
|
一轮扩增产物1（扩增子1） |
2~4μL |
|
一轮扩增产物1（扩增子2） |
2μL |
|
一轮引物F1（10 μM） |
2μL |
|
一轮引物R2（10 μM） |
2 μL |
|
ddH2O |
To 50 μL |
表6.二轮PCR程序设置（与一轮程序相同）
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温度 |
时间 |
循环数 |
|
98°C |
30 sec |
1 |
|
98°C |
10 sec |
30-35（根据实验要求） |
|
60°C |
5 sec |
|
|
72°C |
10 sec/kb |
|
|
72°C |
2 min |
1 |
|
4°C |
Hold |
- |
【注】若Overlap产物杂带较多，可以考虑将一轮扩增产物（扩增子1、扩增子2）纯化后，再做二轮扩增。
2，质粒扩增
表7 .PCR 反应体系配制（50 μL体系）
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组分 |
使用量 |
|
2×High-Fidelity Long PCR Master Mix (With Dye) |
25 μL |
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pCAMBIA2301 |
10~100 ng |
|
正向引物 F（10 μM） |
2 μL |
|
反向引物 R（10 μM） |
2 μL |
|
ddH2O |
To 50 μL |
表8.PCR程序设置
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温度 |
时间 |
循环数 |
|
98°C |
3 min |
1 |
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98°C |
10 sec* |
30-40（根据实验要求） |
|
60°C** |
5 sec |
|
|
72°C*** |
10 sec/kb |
|
|
72°C |
2 min |
1 |
|
4°C |
Hold |
- |
*若质粒为结构紧密的超螺旋，可以适当延长变性时间。
**退火温度推荐使用60°C，也可根据需要，设立温度梯度去摸索引物退火的最适温度，当产量低时可下调退火温度，当产物特异性差时，则上调退火温度。推荐退火时间为5 sec，可以在5-20 sec内调节。退火时间太长可能导致扩增产物在胶上呈弥散状。
***延伸温度和时间：10 kb以上长片段或较高GC片段扩增，推荐使用68°C，10 kb及10 kb以下片段且gc在40%~60%的片段扩增，可以尝试72℃延伸。当扩增效果不理想时，延伸速率根据实际结果可在5 sec/kb~10 sec/kb之间进行调整，扩增片段＜10 kb时，延伸时间可选5 sec，当扩增片段≥10 kb时，延伸速率可选10 sec/kb。